طريقة كيربي- باير

Antibiotics susceptibility testing
Disc-diffusion method (Kerby – Bauer method)
وهي من اكثر الطرق الشائعة الاستعمال روتينيا في مختبرات التشخيص ويعتمد على تلقيح البكتيريا قيد الاختبار على وسط زرعي صلب في طبق بتري وتستعمل Blotting paper disc تحوي المضادات المختلفة بتراكيز مختلفة وتوضع على سطح الوسط الملقح وخلال فترة الحضن ينتشر المضاد من القرص الى الوسط فأذا كان الكائن حساس للمضاد تظهر مناطق انعدام النمو حول القرص, وكلما كانت الحساسية اكبر كان قطر منطقة التثبيط اكبر.
ويمكن تحضير اقراص مضاد معين في المختبر باستخدام ورق النشاف Blotting paper كالاتي:
يثقب ورق النشاف بقطر 5 ملم (يفضل استخدام ورق نشاف No.3) وتنشر في طبق بتري و تعقم, ثم تبرد وتغمر في محلول المضاد الحياتي المحضر بتركيز معين. وتجفف في ظروف معقمة وبعدها يمكن ان تستعمل الاقراص لاجراء الاختبارات بوضعها على سطح الوسط الملقح بالبكتيريا.
العوامل المؤثرة على نتائج اختبار الانتشار
1- معدل انتشار المضاد Rate of diffusion of drug
هذا يعتمد بشكل كبير على الوزن الجزيئي للمضاد ,فالبنسلسن له وزن جزيئي واطئ لذلك ينتشر بسرعة في الاكار بينما Polymyxin يمتلك وزن جزيئي عالي وينتشر بشكل بطيء جدا . وقد يتأثر معدل الانتشار بالتفاعل الكيميائي بين المضاد والوسط.
2- الوسط الزرعي The culture media
أ- مكونات الوسط Medium constituents : فالوسط المثالي يجب ان لا يحتوي على أي مواد مضادة Antagonists لفعالية المضاد وبعض الاوساط تكون غير مناسبة لاجراء اختبار الحساسية اذا كانت مفنقرة الى القدرة على دعم نمو جيد للاحياء المجهرية الممرضة.
ب- حامضية الوسط pH of the medium
يؤثر على فعالية عدة مضادات وان اختبارات الحساسية بشكل عام يفضل اجرائها في pH فريب من pH جسم الانسان.
ج- المعادن والاملاح Minerals & Salts
لوحظ ان ال Monovalant cations تحفز فعالية عدة مضادات مثل Bacitracin و Novobiocin ضد Staphylococci والبنسلين ضد Proteus .بينما لوحظ ان Divalent cataions ممكن ان تقلل حجم مناطق التثبيط لارتباطها مع التتراسايكلين.
كذلك لوحظ ان المجاميع الكبريتية والحامضية في الاكار ترتبط بالمضادات الببتيدية مثل Polymyxin او بالمضادات ذات المجاميع القاعدية مثل Kanamycin.
د- الكاربوهيدرات Carbohydrate
ربما تزيد من مناطق التثبيط لبعض الاحياء المجهرية ولبعض المضادات.
ه- الدم The blood
لوحظ ان هنالك مناطق تثبيط اصغر بالنسبة للمضادات التي لها اواصر بروتينية مثل Fusidic acid و Novobiocin.

الوسط المثالي المناسب لاجراء اختبار الحساسية Ideal sensitivity test medium
1- محتوياته يجب ان تكون معروفة تماما.
2- يجب ان لا يكون اغنائيا بحيث يدعم النمو السريع للبكتيريا .
3- يجب ان لا تكون محتوياته مضادة لاي عامل مضاد للبكتيريا.
4- يجب ان لا يحدث أي تغيير في ال pH اثناء النمو.
5- يجب ان يكون Isotonic تقريبا.


3- عمق الوسط depth of the medium
مناطق التثبيط تزداد في الحجم كلما كان عمق الاكار اقل وان الوسط ذو الطبقة الخفيفة من الاكار يجب تجنبه تماما , وان 4 ملم هو السمك المناسب من الاكار.
4- كثافة اللقاح Density of inoculum
تؤثر على حجم مناطق التثبيط حيث لوحظ ان اللقاح القليل very light inoculum ربما ينتج خطأ بسبب صعوبة التقييم الدقيق لحافة المنطقة المتكونة Zone edge وقد تتكون مناطق تثبيط كبيرة خاصة اذا كان اللقاح Very light.الطريقة المثلى هي طريقة الزرع المحتشد Semi-confluent growth ووجد ان طريقة التلقيح لها تاثير في كثافة التلقيح.





تقنيات التلقيح
تؤثر طريقة التلقيح في توازن وانتشار النمو على الوسط , وان افضل النتائج تم الحصول عليها بطريقة ال Flooding او بطريقة Agar overlay method.
A- Flooding method :
يوضع العالق البكتيري على سطح الاكار بكمية ملائمة وبشكل قطرات موزعة على سطح الوسط بواسطة ماصة باستور ويميل الوسط من جانب لاخر لضمان تغطية سطح الوسط تماما بالقاح ثم يميل الوسط جانبا للتخلص من اللقاح الزائد الذي يسحب او يزال بواسطة ماصة باستور.يجب الحذر من العالق البكتيري المزال خاصة اذا كان لبكتيريا مرضية.
B- Agar overlay method:
عالق البكتيريا يخفف ويمزج جيدا مع الاكار المبرد الى 45 م ثم يصب فوق طبقة اكار قاعدية تصب مسبقا في الطبق. لوحظ ان هذه الطريقة اعطت نتائج جيدة مقارنة مع الطرق الاخرى.
C- Swabbing by swab.
D- Spreading by spreader.
E- Streaking by loop.
5- مدة الحضانة Incubation period
يجب ان تكون اقل ما يمكن (لا تتجاوز 24 ساعة) اما اذا كانت المدة طويلة فسيحدث فقدان لفعالية المضاد مما يسمح للخلايا الحساسة التي تثبط نموها بالمضاد ان تنمو مرة اخرى لذلك تستعمل هذه الطريقة للكائنات سريعة النمو .
6- الاقراص The discs
يجب ان نأخذ بنضر الاعتبار حفظ الاقراص في ظروف مناسبة (4م) وعدم تجاوز مدة الصلاحية وعدد الاقراص المسموح به في الطبق الواحد والمسافات بينها.
7- نوع الكائن المجهري Type of microorganism

* Control cultures : هي بعض انواع البكتيريا المعروفة من ناحية استجابتها للمضادات الحيوية وهي تستعمل لغرض المقارنة مع النتائج التي نحصل عليها عمليا .


The theory of zone formation
ينتشر المضاد خلال الوسط الزرعي بمعدل يعتمد على الوزن الجزيئي والتركيب الكيميائي للمضاد والوسط ويتدرج التركيز من القرص الى حافة منطقة التثبيط المتكونة, حيث يكون التركيز عالي قرب القرص ويقل او يتناقص بعيدا عنه.يعبر عن محتوى القرص بالكمية Absolute amount.
التركيز الحرج من المضاد Critical concentration هو اقل تركيز من المضاد يمكن ان يثبط المايكروب المراد اختبار حساسيته عند حافة منطقة التثبيط Zone edge وهو يتكون اعتمادا على حساسية المايكروب للمضاد وهو مرتبط تماما بالتركيز المثبط الادنى (MIC) .
وان المسافة من القرص الى حافة منطقة التثبيط المتكونة يعتمد على عدة عوامل منها :
1- حجم اللقاح
2- معدل نمو الكائن
3- حضن الطبق قبل وضع الاقراص Preincubation.
4- انتشار المضاد من القرص قبل الحضن Prediffusion.

الكثافة الحرجة للكائن Critical density هي كثافة اللقاح التي تثبط بفعل المضاد عند حافة المنطقة وهي تعتمد على الكائن والمضاد.
فاذا كان اللقاح اكثر من الكثافة الحرجة للكائن فان منطقة التثبيط لا تتكون , واذا كان اللقاح اقل من الكثافة الحرجة للكائن فان مناطق التثبيط سوف تكون كبيرة جدا.
وفي حالة المايكروبات بطيئة النمو يكون انتشار المضاد اسرع من النمو لذلك تظهر مناطق تثبيط كبيرة (غير حقيقية).


طريقة العمل
1- يحضر وسط Muller Hinton agar حيث انه افضل الاوساط المختبرية لتنمية اغلب البكتيريا الممرضة.
2- يتم تلقيح الوسط بشكل كثيف بالبكتيريا التي نريد اختبارها تحت ظروف معقمة ( بطريقة التخطيط Streaking ويمكن استخدام طريقة المسح swabbing).
3- بعد ان يجف اللقاح ,وباستخدام الملقط المعقم بالكحول توضع اقراص المضادات الحيوية على سطح الوسط وبمسافات متباعدة ومتساوية ولا يوصى بوضع اكثر من ستة اقراص في الطبق.
4- يحضن الطبق لمدة 18 ساعة (لاتزيد عن 24 ساعة) في درجة 37 م.
5- تقرا مناطق التثبيط حول كل قرص بالملم وتسجل النتائج.