حساب العدد الكلي الحي للبكتريا الهوائية Enumeration of aerobic bacteria count
اعتمدت طريقة صب الاطباق (Plate pour) في تقدير العدد الكلي الحي للبكتريا , اذ حضرت سلسلة تخافيف من عينة الماء لغاية 10-5 بأستعمال المحلول الملحي الوظيفي(0.85%) (Physiological normal saline) سحب 0.2 مل من كل تخفيف بواسطة ماصة زجاجية معقمة وتم نشرها على وسط الغراء المغذي (Nutrient agar) بواسطة الناشر الزجاجي (Spreader) وبواقع مكريين لكل تخفيف ثم وضعت الاطباق بشكل مقلوب في الحاضنة عند درجة حرارة 37مo و لمدة 48-24 ساعة . تم حساب المستعمرات النامية بالعد القياسي للاطباق (Standard plate count) و على ان يتراوح اعداد المستعمرات في كل طبق بين 300-30 مستعمرة تمهيدا لحساب الوحدات المكونة للمستعمرات(Colony forming units (CFU) لكل مل في عينات المياه كما ذكر في (1996) WHO و حسب المعادلة الاتية :
Number of CFU/ml=number of colonies x 1/dilution factor x plating factor
.18.5.2.3 حساب العدد الكلي لبكتريا القولون total coliform of Enumeration
استعملت طريقة العد الاكثر احتمالا (Most probable number (MPN) المذكورة في (1998) APHA في الكشف عن بكتريا القولون اذ حضرت سلسلة تخافيف لعينة الماء ومجموعة من انابيب الاختبار(ثلاث مجاميع بثلاث انابيب) اذ جرى الاختبار الافتراضي(Presumptive test) و ذلك باضافة 10 مل من وسط مرق ماكونكي السائل ذي التركيز المفرد(Single strength) في مجموعتين من انابيب الاختبار و المضاعف (Double strength) في مجموعة ثالثة و وضع انبوب درهم(Durham`s tube) بشكل مقلوب في كل الانابيب و تم تلقيح هذه الانابيب بثلاث تخافيف من ماء العينة. لقحت الانابيب ( التركيز المفرد ) بالحجوم 0.1,1 مل من ماء العينة و الانابيب ( التركيز المضاعف ) بحجم10 مل من ماء العينة . حضنت الانابيب الملقحة عند درجة حرارة 35م oلمدة 24 ساعة . ان تغير لون الوسط من الوردي الى الاصفر وكذلك تجمع الغاز في انابيب درهم دلالة على النتيجة الموجبة .
و لتاكيد ان البكتريا التي خمرت الوسط الزرعي( تغيير لون الوسط الزرعي الى اللون الاصفر) وحررت الغاز في الاختبار السابق هي من البكتريا المعوية (الاختبار التاكيدي (Confirmed test فقد تم زرعها على وسط غراء الايوسين المثلين الازرق بتقنية التخطيط وحضنت عند درجة حرارة 35مo لمدة 24 ساعة. ان ظهور مستعمرات بمظهر اخضر معدني لماع داكن اللون دلالة على ان عائدية المستعمرات هي لبكتريا القولون.
اما الاختبار التكميلي (Completed test) فقد تم بتلقيح وسط مرق اللاكتوز (Lactose broth) الحاوي على املاح الصفراء في انابيب اختبار حاوية على انبوبة درهم من الانابيب السابقة (النتيجة الموجبة) و حضنت لمدة 24 ساعة عند درجة حرارة 35مo. ان تخمر الوسط و تحرر الغاز هو دليل على ان البكتريا عائدة لبكتريا القولون , وللتعرف على الخصائص المظهرية للخلايا صبغت المستعمرات الموجبة (اعتمادا على صفاتها المظهرية) من الاختبار التاكيدي, بصبغة كرام و فحصت تحت القوة الكبرى الزيتية للمجهر الضوئي المركب . ان ظهور عصيات قصيرة و سميكة سالبة لصبغة كرام و غير مكونة للسبورات هي احدى العلامات التشخيصية لبكتريا القولون.
.19.5.2.3 حساب عدد بكتريا القولون البرازية fecal coliform Enumeration of
استخدمت طريقة العد الاكثر احتمالا (Most probable number) لعد بكتريا القولون البرازية , اذ تم تلقيح انابيب حاوية على وسط مرق الماكونكي وموضوع فيها انابيب درهم, بنموذج من الانابيب الموجبة في فحص بكتريا القولون بواسطة العروة (loop) وحضنت عند درجة حرارة 44.5مo لمدة 24 ساعة. حسب عدد الانابيب الموجبة و التي تكون فيها غاز و من خلال جداول خاصة للعد الاكثر احتمالا حسب عدد بكتريا القولون البرازية في 100مل من العينة (APHA, 1998) .
.20.5.2.3 حساب عدد المسبحيات البرازية fecal streptococci Enumeration of
اتبعت طريقة MPN و الواردة في (1998) APHA لحساب عدد بكتريا المسبحيات البرازية و ذلك بنقل تخافيف العينة الى انابيب حاوية على وسط مرق أزايد دكستروز (Azide dextrose broth) . حضنت الانابيب عند درجة حرارة 37مo لمدة 24 ساعة اذ ان عدد الانابيب الموجبة و التي تمثل ظهور الرواسب و العكورة فيها وكذلك تغير لون الوسط من البنفسجي الى الاصفر دلالة على النتيجة الموجبة.
6.2.3التشخيص Diagnosis
تم تشخيص المستعمرات النامية على الاوساط الزرعية و الخلايا البكتيرية المصبوغة بصبغة كرام كما ذكر في Macfaddine (2000) و ذلك بدراسة الخصائص المظهرية للمستعمرات و التي تضمنت شكلها و لونها و حوافها و قطرها و درجة شفافيتها وقوامها وكذلك للخلايا لإيضاح معاينتها تحت المجهر الضوئي من خلال شكل الخلايا و انتظامها مع بعضها و نوع تفاعلها مع صبغة كرام.