استخلاص الحامض النووي البلازميدي

استخلاص الحامض النووي البلازميدي
DNA من البكتريا السالبة لصبغة غرام (E.coli):
البلازميدplasmid :
البلازميد plasmid هو قطعة مزدوجة حلقية DNA خارج كروموسومية ,يتراوح وجوده من نسخة واحدة الى عدة مئات من النسخ حيث ان حجمه يتراوح منkilobase-pair 1000-1 اضافة الى ان البلازميد مهما كان كبيرا يعد صغيرا بالنسبة الى حجم الكروموسوم .اول من اكتشف البلازميد هو العالم الامريكي جوشا ليدربيرك . Joshua Lederberg

اولا: تنمية البكتريا
1. تنمى البكتريا المراد استخلاص بلازميداتها في دورق سعة 50 مل حاوي على 20 مل من وسط الاكار المغذي السائل (Nutrient broth) .
2. يحضن دورق المزرعة بدرجة حرارة 37 م في حاضنة هزازة بسرعة 200 دورة/دقيقة لمدة24 ساعة، ثم يضاف لها مضاد الكلورامفنيكول بتركيز 70 مايكروغرام/مل ويحضن بنفس الظروف لمدة 2_4 ساعات .(يعمل المضاد الحيوي على تثبيط انتاج البروتينات الضرورية لتضاعف الكروموسوم البكتيري وانقسام البكتريا مما يزيد من عدد نسخ البلازميدات لكل خلية بكتيرية)
3. ينقل النمو البكتيري الى انابيب طرد مركزي معقمة وينبذ بسرعة 3000 دورة/دقيقةلمدة 10 دقائق ، ثم يزال الرائق ويذاب الراشح في 5 مل من دارئ STE و ينبذ بنفس السرعة وتكرر هذه الخطوة لمرتين ثم تحفظ الانابيب بدرجة حرارة 4 م لحين الاستخلاص. (للتخلص من مكونات الوسط) .


ثانيا:استخلاص البلازميدات باستخدام عدة (الكت)المزودة من شركة promega :
1- ضع 600 µl من العينة في انبوبة ابندروف سعة 1.5 مل .
2- اضف الى العينة 100 µl من محلول Cell Lysis Buffer ثم امزج بقلب الانبوب 6 مرات .
3- اضف 350 µl من محلول Neutralization Solution, المبرد في درجة (4-8 )?C .ثم امزج جيدا بالتقليب المستمر.
4- ضع الانبوبة في جهاز الطرد المركزي في السرعة القصوى لمدة 3 دقائق.
5- انقل من الرائق مايعادل 900 ?l الى انبوبة PureYield™ Minicolumn احذر عدم نقل الراسب اوجزء منه الى الانبوبة.
6- ضع الانبوبة minicolumn في انبوبة الجمع Collection Tube, ثم ضعها في جهاز الطرد المركزي بالسرعه القصوى لمدة 15 sec.
7- اهمل الانبوبة coloum tube واستبدلها بانبوبة جمع جديدة.
8- اضف 200 ?l من محلول Endotoxin Removal Wash (ERB) الى الانبوبة ثم ادخلها لجهاز الطرد المركزي بالسرعة القصوى لمدة 15 sec .
9- اضف 400 ?l من محلول Column Wash Solution (CWC) الى الانبوبة ثم ادخلها جهاز الطرد المركزي بالسرعة القصوى لمدة 30 sec .
10- ضع انبوبة minicolumn في انبوبة ابندروف ثم اضف30 ?l من محلول Elution Buffer or nuclease-free water مباشرة ثم اتركها بدرجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة.
11- اطرد الانبوبة مركزيا بالقوة القصوى لمدة 15 sec ثم اهمل انبوبة minicolumn واغلق انبوبة الابندروف لانها حاوية على DNA ثم احفظها بدرجة -20 ?C.