تقنية الاليزا

تقنية الاليزا
Enzyme linked Immuno-sorbent Assay
ELISA

تعد تقنية Elisa من تقنيات المختبرية التشخيصية الواسعة الاستخدام في معظم مختبرات التحليلات المرضية و خاصة في تشخيص الفايروسات وذلك للاسباب التالية:
1. تحليل عدد كبير من العينات.
2. تستغرق وقت قليل نسبيا.
3. الحساسية (Sensitivity) العالية، حيث تبلغ 99%.

مبدأ عمل تقنية ELISA
تستند هذه التقنية على مبدأ Enzyme immunoassay EIA. في هذه التقنية تثبت الاضداد او المستضدات في حفر صفيحة بلاستيكية تدعى Microtiter plate. توضع عينات مصل المرضى وعينات السيطرة في حفر الـ microtiter plate فيحدث ارتباط بين الاضداد و المستضدات. و بعد ساعة من الحضانة في درجة حرارة الغرفة، تغسل الـصفيحة بواسطة محلول غسل خاص لازالة المواد غير المرتبطة. بعد ذلك يضاف انزيم مرتبط بجزيئة الضد Enzyme conjugate و يحضن لمدة نصف ساعة. وبعد خطة غسل اخرى يتم اضافة المادة الاساس Substrate وتحضن الصفيحة لمدة 20 دقيقة ، حيث يظهر لون (أزرق عادة) في الحفر. ثم يضاف بعد ذلك محلول Stop solution حيث يتغير اللون من الازرق الى الاصفر. تقاس شدة اللون باستخدام جهاز المطياف بطول موجي 450 nm. يتناسب تركيز الضد او المستضد المراد قياسه مع شدة اللون تناسبا طرديا.

المواد المطلوبة
1. Microtiter strips : تحتوي على الضد او المستضد مثبت في الحفر.
2. محاليل السيطرة القياسية Standards: وتتضمن :
• Negative control .
• Cut-off standard .
• Weakly positive control.
• Positive control.
3. Enzyme conjugate: يحتوي على اضداد مرتبطة مع انزيم Peroxidase .
4. TMB substrate solution : تحتوي على مادة TMB) Tetramethylbenzidine ).
5. TMB stop solution : ويحتوي على حامض الكبريتيك (H2SO4).
6. محلول التخفيف Sample diluents : ويحتوي على Phosphate buffer saline + potassium tetraiodomercurate (0.01%).
7. محلول الغسل Wash buffer : و يحتوي على Phosphate buffer saline.
8. Automatic pipette .
9. ماء مقطر.
10. جهاز مطياف خاص Microtiter spectrophotometer أو (ELISA reader) .
11. جهاز غسل Microtiter ELISA washer.

طريقة العمل:
1. يخفف مصل المرضى 1:100 بواسطة محلول التخفيف.
2. يخفف محلول الغسل بالماء المقطر 1:10.
3. توضع العينات و عينات السيطرة في حفر الـMicrotiter plate .
4. تغلف الـ Microtiter plate بغطاء بلاستيكي و تحضن بدرجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة.
5. تغسل الصفيحة بمحلول الغسل.
6. يضاف محلول Enzyme conjugate لكل حفرة.
7. تحضن الصفيحة 30 دقيقة بدرجة حرارة الغرفة.
8. تغسل الصفيحة.
9. يضاف محلول TMB substrate لكل حفرة.
10. تحضن الصفيحة لمدة 20 دقيقة.
11. يوقف التفاعل باضافة محلول TMB stop solution لكل حفرة.
12. ترج الصفيحة بهدوء وتقرأ النتائج بجهاز المطياف على طول موجي 450 nm .

التقييم الكمي Quantitative evaluation :
لاجل القيام بالتقييم الكمي للأضداد او المستضدات الخاصة بالفايروس المطلوب يتم عمل منحنى قياسي بين قيمة الكثافة الضوئية (O.D.)و تراكيز محاليل السيطرة القياسية، ومن خلال هذا المنحني يتم استخراج معادلة المنحني القياسي. وبذلك يمكن قياس تركيز الضد او المستضد اعتمادا على الكثافة الضوئية المقاسة بالمطياف.

التقييم النوعي Qualitative evaluation :
لاجل التقييم النوعي يتم قياس الـكثافة الضوئية لمصل المرضى و يقارن بقيمة الكثافة الضوئية لـCut-off standard . اذا كانت قيمة الكثافة الضوئية للعينة اعلى من قيمة cut-off تعتبر العينة موجبة. اما اذا كانت قيمة الكثافة الضوئية للعينة اقل من الـ cut-off فتعتبر العينة سالبة.